In de bekende televisieserie Totally Spies! ontdekken drie goede vriendinnen uit Beverly Hills een groot spionagenetwerk op de plek waar zij wonen. De geheime dienst twijfelt niet en biedt de drie een baan aan, om het netwerk op die manier geheim te houden. In Totally Spies! 4 kunnen spelers weer aan de slag met de drie meiden Clover, Sam en Alex.

In dit vierde deel op de Nintendo DS krijgen de spionnes te maken met een wereldwijd mysterie. WHOOP (World Organisation of Human Protection) geeft de heldinnen de opdracht dit mysterie te ontrafelen en op te lossen. Jij neemt daarbij de rol op je van één van de drie meiden en reist de hele wereld over om een reeks minigames te spelen, verschillende steden te bezoeken en te ontdekken, en uiteindelijk te vechten tegen een echte eindbaas.